2.2 HPLC法检测PQQ

本实验首先研究了其他色谱柱检测PQQ，吡咯结果发现普通C18柱无法使PQQ有效保留，喹啉醌产更换流动相甲醇和乙腈，生菌或者是选和梯度洗脱都不能保留PQQ。另外发现改变pH可以使PQQ有所保留，菌种鉴定但峰形较差，吡咯且拖尾严重，喹啉醌产并且不能很好分离样品发酵液中的生菌PQQ。考虑到PQQ极性较大，选和因此采用耐100%水的菌种鉴定COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色谱柱来使PQQ有很好的保留。将准备好的吡咯7个不同浓度的PQQ标准品（100，50，喹啉醌产25，生菌12.5，选和6.125，菌种鉴定5，2.5 mg/L）进行HPLC检测，每个浓度连续进样3次，每次进样20 μ L。结果如图1所示。不同浓度的PQQ均在3.56 min左右出峰。随着PQQ浓度的增加，峰面积也逐渐增加。因此PQQ浓度与峰面积呈正相关的关系。以PQQ浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性关系为y=30.27x+7.32，R2=0.9998，说明线性关系良好。采用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色谱柱检测PQQ，运行时间短，PQQ出峰时间早，检测效率高。本实验建立的HPLC法检测PQQ具有良好的可行性，可作为菌种产PQQ的复筛方法。

2.3菌株的筛选和鉴定

经光谱法初筛，从100多个样品中筛选到50多株PQQ产生菌，大多数的产量在2~5 mg/L，少数可以达到10 mg/L左右，HPLC复筛后其中PQQ产量最高的1株为20.6 mg/L，峰图如图2所示，PQQ在3.57 min出峰，这是未经优化已报道的摇瓶较高产量。

该菌株的菌落在甲醇培养基平板上为乳白色，粘稠的，边缘整齐，直径较小，为1~2 mm。菌体细胞为球状，革兰氏阴性，不产芽孢，有荚膜，无鞭毛。该菌株在以甲醇和甲胺为碳源的培养基中能够良好生长，能利用D-葡萄糖，蔗糖，果糖和木糖。在以铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏为氮源的培养基中能良好生长。采用PCR技术扩增该菌株的16s rDNA 基因序列，经上海生工测序。通过在 NCBI网站中进行同源性序列搜索及比对，从中选取同源性较高菌株的16s rDNA基因序列，以集团外菌种作对照，通过MEGA软件，用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。结果如图3所示，该菌株与 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的同源性最高，为99%。综合菌落及菌体形态特征、16s rDNA序列分析，鉴定该菌株为Methylopila sp.菌株，命名为Methylopila sp.Z1。

2.4 甲醇含量的优化

研究甲醇的不同添加浓度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）对OD600和PQQ产量的影响，结果如图4所示。在0.5%~2.5%的浓度范围内，随着甲醇体积浓度的提高，菌体OD600和PQQ产量也逐渐提高，当甲醇浓度为2.5%时，OD600和PQQ产量均达到最高，继续增加甲醇浓度，OD600和PQQ产量均有明显下降。这是因为甲醇作为细菌生长的唯一碳源，并且还是细菌细胞甲醇脱氢酶的底物，在其浓度较低时，不足以提供能量使细胞生长，也无法生产过量的PQQ排泄到培养基中，导致PQQ合成效率非常低。当甲醇浓度逐渐提高时，细胞所能利用的碳源增加，菌体OD600和PQQ产量也逐渐增加；当甲醇浓度超过2.5%时，由于甲醇的毒性使细胞损伤，并且底物浓度过高抑制甲醇脱氢酶的活性，导致菌体OD600和PQQ产量下降。因此，2.5%的甲醇体积浓度对于菌体生长和PQQ合成是最佳选择。

3 结论

目前PQQ的检测方法主要有重组酶法，氧化还原法，光谱法和HPLC，其中重组酶法所用到的葡萄糖脱氢酶提取繁琐，纯化过程复杂，且得到的酶活不高，不足以支持大量的菌种筛选；氧化还原法中用到的显色剂氯化硝基四氮唑蓝（NBT）易受培养基中其他成分的干扰，造成阴性结果。光谱法操作简单，检测快速，但也可能受到培养基中具有相似波长吸光度的影响，但本实验采用的是甲醇无机培养基，并通过HPLC检测样品发现，基本没有干扰，因此光谱法作为PQQ产生菌的初筛是高效可行的。本实验还建立了新的HPLC法检测PQQ，采用亲水色谱柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ，使得PQQ有很好的保留，并且样品运行时间短，PQQ在3.56 min出峰，出峰时间早，检测时间短，峰形无拖尾，为PQQ检测提供一种新的改进方法。

由于PQQ的生物合成机理没有得到完全阐释，通过基因工程和代谢改造提高PQQ的产量远低于野生菌的产量，因此从环境中筛选具有高产PQQ能力的菌种是十分必要的。本实验从样品中筛选到一株PQQ高产菌，经鉴定为Methylopila sp.属，命名为Methylopila_sp. Z1，未经优化的摇瓶产量达到20.6 mg/L，属于已报道的较高水平。Z1菌株耐受较高甲醇，在培养基甲醇浓度为2.5%时，PQQ产量达26.7 mg/L，相比于初始浓度提高了28%。Z1是一株有高产PQQ潜力的菌株，后续发酵罐培养和优化工艺将进一步提高PQQ产量。

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